×
Info! Artikel ini sudah diperbaharui pada tanggal 16 April 2022.
Pendahuluan
Menghitung jumlah sel eosinofil matode visual hemositometer diperlukan untuk lebih akurat menentukan jumlah total eosinofil/L darah. Jumlah relatif dan absolut sel eosinofil dalam darah juga dapat ditentukan dari diffcount jumlah sel darah putih atau sel leukosit. Metode visual menghitung eosinofil mirip dengan metode yang digunakan untuk jumlah sel eritrosit (sel darah merah) dan sel leukosit (sel darah putih). Pada penjelsan pada artikel ini kami memakai bilik hitung atau hemocytometer improved neubauer (pelajari dasar hemocytometer improved neubauer). Perhitung sel eosinofil kita bisa menggunakan bilik hitung lain yaitu fuchs-rosenthal dan atau speirs-levy.
Nilai normal sel eosinofil adalah 50-350 X 106/L. Jumlah seleosinofil kurang dari normal (eosinopenia) ditemukan pada hiperadrenalisme (penyakit Cushing), syok, dan setelah pemberian adrenocorticotropic hormone (ACTH). Sedangkan pada kelebihan jumlah sel eosinofil (eosinofilia) terjadi pada reaksi alergi, infestasi parasit, brucellosis, dan leukemia tertentu. Menurut Barbara Brown ada kemungkinan variasi jumlah sel eosinofil yang cukup besar selama periode 24 jam, dengan jumlah terendah umumnya terjadi pada pagi hari dan jumlah tertinggi terjadi pada malam hari (tengah malam dan setelahnya).
Menghitung jumlah sel eosinofil matode visual menggunakan sampel darah dengan antikoagulan EDTA atau Oxalat. Kemudian reagen yang digunakan menurut Gandasoebrata adalah eosin 2% ditambah aceton 1 : 1 jadi jika esoin 2% 5ml maka aceton juga 5 ml kemudian ad aquadest 100 ml. Jika reagen sisa maka simpanlah di lemari es larutan tahan samapai 1 minggu dan saat mau dipakai saring terlebih dahulu. Berikut ini cara pembuatan reagen esoin aceton dan alternatif reagen lainnya yang bisa digunakan untuk pengenceran.
Larutan Dunger
Pewarnaan eosin dari butiran eosinofil berwarna merah cerah, air digunakan untuk melisiskan sel darah merah dan aseton digunakan untuk fiksasi eosinofil.
Alternatif larutan pengenceran :
Larutan Phyloxine
Campur, saring, dan simpan pada suhu kamar. Stabil selama 1 bulan.
Larutan Pilot disiapkan dengan cara yang sama seperti cairan pengencer filoksin (di atas) kecuali 100 unit heparin ditambahkan ke dalam campuran akhir.
Larutan Randolph
Simpan larutan 1 dan 2 pada suhu kamar. Sebelum digunakan, campurkan kedua larutan dengan volume yang sama. Campuran ini stabil selama 4 jam.
Menghitung jumlah sel eosinofil matode visual hemositometer diperlukan untuk lebih akurat menentukan jumlah total eosinofil/L darah. Jumlah relatif dan absolut sel eosinofil dalam darah juga dapat ditentukan dari diffcount jumlah sel darah putih atau sel leukosit. Metode visual menghitung eosinofil mirip dengan metode yang digunakan untuk jumlah sel eritrosit (sel darah merah) dan sel leukosit (sel darah putih). Pada penjelsan pada artikel ini kami memakai bilik hitung atau hemocytometer improved neubauer (pelajari dasar hemocytometer improved neubauer). Perhitung sel eosinofil kita bisa menggunakan bilik hitung lain yaitu fuchs-rosenthal dan atau speirs-levy.
Nilai normal sel eosinofil adalah 50-350 X 106/L. Jumlah seleosinofil kurang dari normal (eosinopenia) ditemukan pada hiperadrenalisme (penyakit Cushing), syok, dan setelah pemberian adrenocorticotropic hormone (ACTH). Sedangkan pada kelebihan jumlah sel eosinofil (eosinofilia) terjadi pada reaksi alergi, infestasi parasit, brucellosis, dan leukemia tertentu. Menurut Barbara Brown ada kemungkinan variasi jumlah sel eosinofil yang cukup besar selama periode 24 jam, dengan jumlah terendah umumnya terjadi pada pagi hari dan jumlah tertinggi terjadi pada malam hari (tengah malam dan setelahnya).
Menghitung jumlah sel eosinofil matode visual menggunakan sampel darah dengan antikoagulan EDTA atau Oxalat. Kemudian reagen yang digunakan menurut Gandasoebrata adalah eosin 2% ditambah aceton 1 : 1 jadi jika esoin 2% 5ml maka aceton juga 5 ml kemudian ad aquadest 100 ml. Jika reagen sisa maka simpanlah di lemari es larutan tahan samapai 1 minggu dan saat mau dipakai saring terlebih dahulu. Berikut ini cara pembuatan reagen esoin aceton dan alternatif reagen lainnya yang bisa digunakan untuk pengenceran.
Larutan Dunger
| Eosin | 200 mg | Mewarnai granula sel eosinofil merah orange |
| Aquadest/Air suling | 90 ml | Melisiskan sel darah merah dan sel darah putih (kecuali eosinofil yang resisten) |
| Aceton | 10 ml | Fiksasi |
Pewarnaan eosin dari butiran eosinofil berwarna merah cerah, air digunakan untuk melisiskan sel darah merah dan aseton digunakan untuk fiksasi eosinofil.
Alternatif larutan pengenceran :
Larutan Phyloxine
| Propylene glycol | 50 mL |
| Aquadest/Air suling | 40 mL |
| Larutan Thyroxine 1% w/v | 10 mL |
| Larutan Sodium carbonate 10% w/v | 1 mL |
Campur, saring, dan simpan pada suhu kamar. Stabil selama 1 bulan.
Larutan Pilot disiapkan dengan cara yang sama seperti cairan pengencer filoksin (di atas) kecuali 100 unit heparin ditambahkan ke dalam campuran akhir.
Larutan Randolph
| Larutan 1 | |
|---|---|
| Methylene blue 0.1% (w/v) dalam propylene glycol | 50 mL |
| Aquadest/Air suling | 50 mL |
| Larutan 1 | |
| Phyloxine 0.1% (w/v) dalam methylene blue | 50 mL |
| Aquadest/Air suling | 50 mL |
Simpan larutan 1 dan 2 pada suhu kamar. Sebelum digunakan, campurkan kedua larutan dengan volume yang sama. Campuran ini stabil selama 4 jam.
Prosedur
Persiapan alat dan bahan sebelum memulai langkah kerja, yaitu paket alat haemacytometer yang berisi bilik hitung improved neubauer, pipet eritrosit (ukuran lebih besar memiliki butiran pengencer berwarna merah), pipet lekosit (ukuran lebih kecil memiliki butiran pengencer berwarna puith), deck glass, dan selang penyedot. Selain itu siapkan juga reagen pengenceran yangsudah deijelaskan di pendahuluan, reagen yangsering dipakai adalah regen Dunger.
Langkah kerja
Perhitungan :
\[ = {N \over V} \times P\]
\[ = \frac{Jumlah \ Sel}{Jumlah \ kotak \times \ (panjang \times lebar \times tinggi)} \times Pengenceran \]
\[ = \frac{N}{9 \times \ (1 \times 1 \times 0,1)} \times 10 \]
\[ = \frac{N}{9 \times \ 0,1} \times 10 \]
\[ = \frac{N}{0,9} \times 10 = \frac{N}{9 \over 10} \times 10 \]
\[ = N \times {10 \over 9} \times {10 \over 1} = N \times {100 \over 9}\]
\[ = N \times 11,11 \]
Jika menghitung 2 bilik hitung akan menjadi:
\[ = \frac{N}{1,8} \times 10 = \frac{N}{18 \over 10} \times 10 \]
\[ = N \times {10 \over 18} \times {10 \over 1} = N \times {100 \over 18}\]
\[ = N \times 5.55 \]
Nilai normal: Barbar brown : 50-350 X 106/L, Harsh Mohan: 40-400/μl, Ramadas Nayak: 40-450 sel/m3 (0,04-0,45 × 109/L).
Catatan:
Sedangkan Harsh Mohan dan Ramadas Nayak et.al meyarakan menggunakan perhitungan yang sama dengan sel leukosit yitu 4 kotak besar jadi \[ = N \times 25 \] untuk melihat perhitungan leukosit silahkan baca disini.
Namun semua referensi menyarankan untuk menggunakan bilik hitung Fuchs-Rosenthal yang terdiri dua bilik hitung. Bilik hitung ini memiliki kedalaman 0,2 mm, setiap area penghitungan yang diatur terdiri dari 1 bujur sangkar besar, 4 mm X 4 mm X 0,2 mm, atau volumenya 3,2 /uL. Kotak besar dibagi menjadi 16 kotak kecil, yang masing-masing berukuran panjang 1 mm dan lebar 1 mm. Masing-masing kotak ini dibagi lagi menjadi 16 kotak yang lebih kecil. Pada perhitungan menggunakan bilik hitung Fuchs-Rosenthal
hasil tidak akan mendapat nilai koma tidak seperti pada perhitungan bilik hitung Improved Neubauer.
Setelah jumlah eosinofil diencerkan, harus dihitung dalam waktu 30 menit. Eosinofil akan mudah hancur dalam cairan pengencer jika dibiarkan terlalu lama diencerkan. Jika Unopette digunakan, penghitungan harus diselesaikan dalam waktu 1 jam setelah diencerkan.
Untuk meningkatkan akurasi penghitungan, setidaknya 100 eosinofil harus dihitung. Untuk melakukan ini, ruang hitung dapat diisi dan dihitung sebanyak yang diperlukan. C.V. dari jumlah eosinofil ketika setidaknya 100 sel dihitung adalah sekitar 10%.
Persiapan alat dan bahan sebelum memulai langkah kerja, yaitu paket alat haemacytometer yang berisi bilik hitung improved neubauer, pipet eritrosit (ukuran lebih besar memiliki butiran pengencer berwarna merah), pipet lekosit (ukuran lebih kecil memiliki butiran pengencer berwarna puith), deck glass, dan selang penyedot. Selain itu siapkan juga reagen pengenceran yangsudah deijelaskan di pendahuluan, reagen yangsering dipakai adalah regen Dunger.
Langkah kerja
- Campurkan sampel darah EDTA dengan lembut, sehingga sel-sel tercampur dengan baik dengan plasma. Mengambil sampel darah menggunakan pipet thoma leukosit hingga tanda 1.0. Bersihkan bagian luar pipet dengan hati-hati. Tambahkan pengencer sampai tanda 11 untuk membuat pengenceran 1:10. Pegang pipet secara horizontal pada sumbu panjangnya, putar perlahan untuk memastikan pencampuran darah dan pengencer secara menyeluruh. Campurkan sampel dalam pipet thoma selama 2-3 menit.
- Tempatkan kaca penutup atau deck glass yang bersih pada area bilik hitung Neubauer. Setelah itu keluarkan 1-2 tetes (karena larutan tidak bercampur dengan darah) campuran dari pipet thoma. Kemudian isi satu sisi ruang penghitung dan isi juga sisi ruangan yang berlawanan. Jika menggunakan dua buah pipet thoma menjadikan kita punya du apengenceran maka pengenceran kedua mengisi sisi ruangan yang berlawanan.
- Biarkan sel mengendap selama 2 menit ada yang sampai 15 menit dengan meletakkan dalam cawan petri dengan selembar kertas saring basah di dalamnya. Selain sel eosinofil akan mengendap sel darah merah dan putih selain sel esoinofil akan lisis kemudian pewarnaan sel eosinofil juga terjadi selama waktu ini terutama pada granula eosinofil jika menggunakan larutan eosin aceton.
- Hitung jumlah eosinofil pada 4 kotak besar menggunakan objektif berdaya rendah (10X). Sel eosinofil dapat diidentifikasi karena granula terwarnai merah cerahnya dan penghitungan harus dilakukan dalam waktu 30 menit. Namun pada prosedur yang di jelaskan Barbarabrown dan Gandasoebrata jika kita menggunakan aturan Improved Neubauer harus menghitung semua kotak besar kedua sisi bilik hitung maka total volume yang dihitung 1,8 ul karena setiap bilik memiliki total volume 0,9 ul.
-
Penjelasannya luas bilik hitung semua kotak ada 9 mm2 dan tinggi 0,1 mm. Jadi perhitungannya dengan pengenceran 10 kali jadi jumlah sel yang didapat dalam bidang 0,9 mm3 dikali 2 maka menghasilkan 1,8 mm3 atau 1,8 ul darah. Untuk lebih jelas berikut ini cara perhitungannya jika dihitung dalam semua kotak besar.
Perhitungan :
\[ = {N \over V} \times P\]
\[ = \frac{Jumlah \ Sel}{Jumlah \ kotak \times \ (panjang \times lebar \times tinggi)} \times Pengenceran \]
\[ = \frac{N}{9 \times \ (1 \times 1 \times 0,1)} \times 10 \]
\[ = \frac{N}{9 \times \ 0,1} \times 10 \]
\[ = \frac{N}{0,9} \times 10 = \frac{N}{9 \over 10} \times 10 \]
\[ = N \times {10 \over 9} \times {10 \over 1} = N \times {100 \over 9}\]
\[ = N \times 11,11 \]
Jika menghitung 2 bilik hitung akan menjadi:
\[ = \frac{N}{1,8} \times 10 = \frac{N}{18 \over 10} \times 10 \]
\[ = N \times {10 \over 18} \times {10 \over 1} = N \times {100 \over 18}\]
\[ = N \times 5.55 \]
Nilai normal: Barbar brown : 50-350 X 106/L, Harsh Mohan: 40-400/μl, Ramadas Nayak: 40-450 sel/m3 (0,04-0,45 × 109/L).
Catatan:
Sedangkan Harsh Mohan dan Ramadas Nayak et.al meyarakan menggunakan perhitungan yang sama dengan sel leukosit yitu 4 kotak besar jadi \[ = N \times 25 \] untuk melihat perhitungan leukosit silahkan baca disini.
Namun semua referensi menyarankan untuk menggunakan bilik hitung Fuchs-Rosenthal yang terdiri dua bilik hitung. Bilik hitung ini memiliki kedalaman 0,2 mm, setiap area penghitungan yang diatur terdiri dari 1 bujur sangkar besar, 4 mm X 4 mm X 0,2 mm, atau volumenya 3,2 /uL. Kotak besar dibagi menjadi 16 kotak kecil, yang masing-masing berukuran panjang 1 mm dan lebar 1 mm. Masing-masing kotak ini dibagi lagi menjadi 16 kotak yang lebih kecil. Pada perhitungan menggunakan bilik hitung Fuchs-Rosenthal
hasil tidak akan mendapat nilai koma tidak seperti pada perhitungan bilik hitung Improved Neubauer.
Setelah jumlah eosinofil diencerkan, harus dihitung dalam waktu 30 menit. Eosinofil akan mudah hancur dalam cairan pengencer jika dibiarkan terlalu lama diencerkan. Jika Unopette digunakan, penghitungan harus diselesaikan dalam waktu 1 jam setelah diencerkan.
Untuk meningkatkan akurasi penghitungan, setidaknya 100 eosinofil harus dihitung. Untuk melakukan ini, ruang hitung dapat diisi dan dihitung sebanyak yang diperlukan. C.V. dari jumlah eosinofil ketika setidaknya 100 sel dihitung adalah sekitar 10%.
Ilustrasi
Pustaka
- Barbara A. Brown, 1993, Hematology : principles and procedures Sixth Edition, Lea & Febiger, Philadelphia, London
- Barbara H. Estridge and Anna P. Reynolds, 2012, Basic Clinical Laboratory Techniques Sixth Edition, Delmar, Cengage Learning
- Ramadas Nayak, Sharada Rai, Astha Gupta, 2012, Essentials in Hematology and Clinical Pathology, Jaypee Brothers Medical Publishers (P) Ltd., New Delhi.
- Harsh Mohan, 2013,Pathology Practical Book, Third Edition, Jaypee Brothers Medical Publishers (P) Ltd., New Delhi.
- Gandasoebrata, Penuntun Laboratorium Klinik, Dian Rakyat, Jakarta,1968
Tidak ada komentar:
Posting Komentar